综上所述，该研讨开发的作业流程处理了大型安排样品制备进程的首要瓶颈问题，将有效地促进冷冻电子断层成像技能在大标准安排样品中的运用。

  冷冻电子断层成像技能（cryoET）是一项正在加快速度进行开展且极具潜力的冷冻电镜技能。相关于冷冻电镜单颗粒技能，这项技能的最大优势是无需经过蛋白纯化流程，便可以研讨生理状况或病理下的生物大分子的原位结构。聚集离子束切开技能（cryoFIB）是现在用于制备生物样品最常用办法之一。但是，因为生物安排体积大，相应的冷冻电子断层成像样品制备依然面对许多应战，包含功率低、样品易碎和定位困难等，极大地约束了冷冻电子断层成像技能在生物安排样品上的运用。

  2023年4月11日，清华大学生命科学学院李雪明课题组与首都医科大学北京友谊医院尤红课题组在《科学陈述》（Scientific Reports）杂志上在线宣布研讨论文，标题为“运用聚集离子束切开技能制备安排的冷冻电子断层成像样品”（CryoFIB milling large tissue samples for cryo-electron tomography）。该论文报导了一种根据聚集离子束切开技能的安排样品制备作业流程，可以将毫米标准的安排样品中的感兴趣区域高效减薄到100–150 纳米的厚度。该办法的开发为运用冷冻电子断层成像技能讨论研讨恣意来历的生物样品供给了或许。

  研讨团队针对安排切开进程中面对的技能难题，规划了一套完好的处理方案，包含安排样品的固定、预减薄、高压冷冻、聚集离子束切开以及根据细胞二次电子像（CSEI）的定位（图1）。其间聚集离子束切开战略包含一个粗切进程和一个精修进程。粗切进程是运用高达65 nA电流和高入射视点的离子束进行切开，能处理厚度达几十微米的样品切开功率问题（图2 a-c）。精修进程则是用聚集离子束切开制备出一个带有导电铂镀层的田埂状（Furrow-Ridge）结构，该结构是取得高质量冷冻电子断层成像数据的要害（图2 d-g）。一方面，Furrow-Ridge结构能很大程度上进步大面积切片的机械强度，使制备低至100 nm左右厚度的薄切片称为或许。薄切片关于完成近原子分辨率的子断层均匀（sub-tomogram averaging）至关重要。另一方面，Ridge外表上的导电性铂镀层是杰出接地的，可以明显消除高能电子束辐照样品时发生的外表电荷，以及由外表电荷引起的图画漂移问题，对进步电子断层图（tomogram）三维重构的分辨率具有极端重大意义。别的，研讨团队经过将根据细胞二次电子像定位办法引进到安排样品切开进程中，不需要额定引进的荧光符号，就能对安排中的感兴趣区域做定位。更重要地，细胞二次电子像技能能在切开进程中进行继续实时成像，并能完成准确的三维定位。依托上述聚集离子束切开战略，大安排样品的冷冻电子断层成像样品制备仅依托一般的冷冻双束扫描电镜就能轻松完成，无需额定的设备；用户仅需简略的训练就可以轻松上手操作。本文作业运用小鼠肝脏安排测试了整个样品制备的作业流程，成功定位并取得了纤维化肝脏中散布很少的胶原纤维高质量断层成像三维密度图，证明了作业流程的高效性和可行性。

  综上所述，该研讨开发的作业流程处理了大型安排样品制备进程的首要瓶颈问题，将有效地促进冷冻电子断层成像技能在大标准安排样品中的运用。

  清华大学生命科学学院李雪明副教授、首都医科大学北京友谊医院尤红教授为本文的一起通讯作者。清华大学生命科学学院2018级博士生王思涵、生命科学学院博士后周珩和首都医科大学北京友谊医院陈巍副研讨员为该论文的一起榜首作者。蔡司显微镜北京客户中心工程师蒋艺丰和首都医科大学北京友谊医院博士生严旭禛为本文的一起作者。清华大学李英博士、李晓敏博士为样品制备和数据搜集供给了大力协助和支撑。本作业得到了国家自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心、北京生物结构前沿研讨中心和结构生物学高精尖立异中心的赞助。